荧光分光光度计的作原理

荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的种仪器。其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数，从各个角度反映了分子的成键和结构情况。通过对这些参数的测定, 不但可以做般的定量分析,而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化,从而阐明分子结构与能之间的关系。荧光分光光度计的激发波长扫描范围般是190~650nm，发射波长扫描范围是200~800nm。可用于液体、固体样品（如凝胶条）的光谱扫描。

　　荧光光谱法具有灵敏度、选择性强、用样量少、方法简便、作曲线线形范围宽等优点，可以广泛应用于生命、学、药学和药理学、有机和无机化学等域。

作原理

物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态， 这些处于激发态的分子是不稳定的，在返回基态的过程中将分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光。

　　不同物质由于分子结构的不同，其激发态能的分布具有各自不同的征，这种征反映在荧光上表现为各种物质都有其征荧光激发和发射光谱；因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地行物质的鉴定。

　　在溶液中，当荧光物质的浓度较低时，其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系，即IF=KC，利用这种关系可以行荧光物质的定量分析，与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法行。

　　1． 荧光发射光谱

　　选择某固定波长的光激发样品，记录样品中产生的荧光发射强度与发射波长间的函数关系，即得荧光发射光谱。

　　2． 荧光激发光谱

　　选定某荧光发射波长记录荧光发射强度作为激发光波长的函数，即得荧光激发光谱。

　　3．时间分辨；

　　可用于对混合物中光谱重叠但有寿命差异的组分行分辨并分别测量。

　　时间分辨荧光测定公式如下：

　　P(t) = P₀EXP (-t/τ)

　　式中P(t)：拟合数函数

　　P₀：强度取值

　　EXP：数运算符

　　t：时间取值

　　τ：荧光平均时间寿命